RNA 추출과 RT-PCR
세포로부터 총 RNA를 추출하기 위해 Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad,
CA, USA)를 사용하였다. 세포가 90%정도 배양된 HCT116-con 세포군,
HCT116-vec 세포군, HCT116-RhoAi 세포군에서 배지를 모두 흡인 제거한
뒤 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS; Cellgro, Herndon, VA)으로
세포를 세척하였다. DPBS를 제거하고 Trypsin EDTA (0.25 %, Cellgro)를 이
용하여 세포를 부유시킨 뒤 1,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심 분리하였다. 세
포 pellet를 회수한 뒤 Trizol reagent 1 ml을 넣어 세포벽을 파괴하였다. 그
후 12,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 새로운 tube로 옮
긴 뒤 chloroform (Sigma, USA) 200 ㎕를 첨가하였다. 다시 12,000 rpm, 4℃
에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 tube로 옮기고 동일한 양의
isoprophanol (Sigma, USA)를 넣고 ?70℃에서 30분간 반응시켰다. 이후 1,200
rpm, 4℃에서 15분간 원심분리 하고 pellet만 남긴 후 70% ethanol을 이용하
여 두 번 세척한 후 pellet을 건조시켜 DEPC (diethyl pyrocarbonate) water
60 ㎕에 용출시켰다. 총 RNA의 양을 측정하기 위하여 NanoDrop (Thermo
scientific, USA)을 사용하였다. 500 ng의 총 RNA에 0.5 U/㎕의 농도인
DNase I (Qiagen, USA)을 처리하여 DNA의 오염을 방지하였다. cDNA로의 역
전사는 ReverTra Ace® qPCR Kit (TOYOBO, Japan)를 사용하여 제공된 방법
에 따라 수행하였다.
mRNA 수준에서의 RhoA의 유전자 발현량을 확인하기 위해 합성된 cDNA
를 주형으로 PCR을 수행하였다. PCR은 Maxime PCR Pre Mix Kit (iNtRON,
Korea)를 사용하여 제공된 방법에 따라 진행하였다. PCR에 사용된 RhoA
primer, GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) primer와
zeocin primer의 서열은 table 3에 표기하였으며 PCR조건은 table 4에 표기
하였다. PCR 후 전기영동은 자동전기영동장비인 QIAxcel System (Qiagen,
USA)를 이용하여 분석하였다.
Western blot
Pro-prep (iNtRON, Korea)을 이용하여 90% 배양된 군별 세포의 단백질을
추출하였다. 각각 세포군에서 배지를 제거한 뒤 Dulbecco's
Phosphate-Buffered Saline (DPBS; Cellgro, Herndon, VA)으로 세척하였다.
이 후 pro-prep (iNtRON, Korea)을 넣고 cell scraper로 부유한 세포를 수거
해 tube로 옮긴 뒤 얼음에서 30분간 방치하여 세포를 융해하였다. 13,000
rpm, 4℃에서 5분간 원심분리 하였다. 침전된 세포부산물을 제거 한 후 투
명한 상층액을 얻었다. 얻은 상층액은 western blot 전 까지 ?80℃에서 보관
하였다. 단백질의 농도를 측정하기 위해서 BCA protein assay kit (Thermo,
Meridian Road, Rockford, USA)를 수행하였다. 표준 단백질로 BSA를 사용하
였으며 Thermo사의 BCA protein assay 시약 200 ㎕와 BSA를 0-2000 ㎍/ml
의 농도로 반응시킨 후 30 분 후에 560 nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡
선을 작성 후 시료를 동일한 조건으로 측정하여 단백질 농도를 계산하였다.
SDS-polyacylamide gel electrophoresis는 각 사료에 대한 정량 후에 동일한
양인 50 ㎍으로 조정 후 Bio-rad사의 sample buffer와 시료를 잘 섞은 후 5
분간 가열하여 단백질을 완전히 변성시켰다. 각 군의 단백질 시료는 10%
polyacrylamide gel에 100V, 60분 동안 분리하였다. Trans-blot turbo
(Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)를 이용하여 분리된 단백질을 0.2 ㎛
polyvinylidene fluoried (PVDF) membrane (Millipore, USA)에 이동하였다
