강한 염색

Tissue Micro Array (TMA) 제작과 면역조직화학염색
Tissue Micro Array (TMA) block section을 사용하여 면역조직화학염색을
진행하였다. TMA 블록 제작을 위한 recipient block에 파라핀 포매한 150 예
의 대장암 FFPE (formalin-fixed paraffin embedded) 블록에서 두 부분의 암
조직을 추출하여 옮겨 심고 다시 파라핀 포매를 진행하였다. 각각의 TMA
블록은 29명의 환자 조직에서 추출된 58개의 core를 가지고 있다. 면역조직
화학염색을 위해 4 ㎛ 두께로 박절한 후 자일렌으로 파라핀을 제거하였고
100%에서 70% 에탄올 순으로 함수하였다. 항원의 재활성을 위하여 압력가
열기에 넣고 0.1 M citrate buffer (pH 6.0)를 이용하여 15분간 전자레인지에
서 가열하였다. 실온에서 2 시간 동안 식힌 후 증류수 1회, PBST (phospated
buffered saline and tween 20, pH 7.4)로 2회 3 분간 세척하였다. 비 특이적
내인성 peroxidase의 제거를 위해 Peroxidase-blocking solution (Dako, USA)
을 30분간 처리하고 PBST (phospated buffered saline and tween 20, pH
7.4)로 세척하였다. 이후 실온에서 일차 항체인 anti-mouse RhoA (Abnova,
1: 500) antibody를 2시간 동안 반응시켰다. 일차 항체 반응 후에 PBST
(phospated buffered saline and tween 20, pH 7.4)로 3회 세척하였다. 30 분
간 enhancer를 처리한 뒤 상온에서 1시간 동안 Dako Envision+System-HRP
labelled polymer anti-mouse (Dako, USA)를 반응시켰다. PBST (phospated
buffered saline and tween 20, pH 7.4)로 3회 세척한 후 DAB
(diamonobenzidine)로 발색하였다. 발색 후 증류수에 3회 세척하고, Mayer’s
hematoxylin으로 핵을 염색하였다.
면역조직화학염색의 판독은 염색의 강도에 따라 발색이 없는 negative, 약
한 염색 positive 1, 중등도 염색 positive 2, 강한 염색 positive 3으로 판독하였다.