이동이 완료된 membrane은 5% 탈지용액에서 1시간동안
비 특이적 단백질을 차단하였다. Membrane은 1:1000으로 희석된 mouse
anti-RhoA monoclonal antibody (Abnova, Taiwan)와 1:5000으로 희석된
mouse anti-β-actin monoclonal antibody (Sigma, USA)에서 4℃, 12시간 반
응 시켰다. 일차 항체 반응 뒤 TBS-T (Tris-buffered saline and Tween 20)
를 이용하여 5회, 각 10분간 membrane을 세척하였다. 이후, 이차 항체인
1:10000으로 희석한 horseradish peroxidase conjugated anti-mouse
immunoglobulins (Sigma, USA)에 membrane을 넣고 상온에서 1시간 동안 반
응시켰다. 반응 뒤 TBS-T (Tris-buffered saline-Tween 20)를 이용하여 5회,
각 10분간 membrane을 세척하였고 단백질 신호를 확인하기 위해 enhanced
chemiluminescence (ECL solution, Advansta, USA) 반응 후 Molecular Imager
ChemiDoc XRS+ System (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)을 사용하여 단백
질의 발현 정도를 측정하였다.
세포증식 측정 (MTT assay)
세포 증식 측정을 위해 대장암 세포주인 HCT116에 형질 도입 후 MTT 분
석을 수행하였다. 형질도입 24시간, 48시간, 72시간 후의 각 세포군의 세포
들을 1.0×105으로 현탁시켜 96 well plate에서 배양을 진행한 후 PBS에 용
해한 5 ㎎/㎖의 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium
bromide; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 처리 한 후 37℃, 4시
간 동안 반응시켜 불용성의 보라색 formazan을 형성시킨다. 4시간 후 배지
를 제거하고 각 well에 200 ㎕의 DMSO (dimethyl sulfoxide; sigma, USA)를
넣은 뒤 plate shaker에서 15분간 반응시켜 침전물을 완전히 용해하였다. 용
해된 formazan 산물이 포함된 각 well은 plate reader의 570nm에서 흡광도를 측정한다.
세포이주 측정 (wound healing assay)
세포의 이주 양상을 알아보기 위해 대장암 세포주인 HCT116에 형질 도입
후 Culture insert system 24 (Ibidi, Munich, Germany)를 이용한 세포이주 측
정 (wound healing assay)을 진행하였다. 6 well plate의 바닥면에 culture
insert를 부착하였다. 부착한 culture insert의 각 well에 각 세포군의 세포들
을 1.0×106로 현탁하여 100 ㎕씩 넣고 insert 안쪽에서 세포가 단층으로 모
두 자랄 때까지 37℃, CO2 배양기에서 2일간 배양하였다. 2일 후 세포가 단
층으로 모두 자란 것을 확인한 뒤 culture insert를 제거하여 세포 간 약 500
㎚의 빈 간격을 만들어주었다. 10% FBS가 포함된 RPMI1640 배지를 넣어주
고 매 12시간 간격으로 phase contrast microscope AxionCam camera (Zeiss,
37030 Gottingen, Germany)를 이용하여 모니터링을 수행하였다. 매 12시간
마다 사진을 찍어 세포간의 거리를 무작위로 10 곳을 측정하고 평균값을 확
인하여 통계적인 분석을 수행하였다.
